Laboratórium farmaceutickej a biomedicínskej analýzy

Zameranie:

Laboratórium separačných analytických metód. Podľa typu analytu a matrice sú aplikovateľné vysokoúčinné elektromigračné (CE) alebo chromatografické (HPLC) separačné metódy a podľa dôrazu na kvantifikáciu alebo štruktúrnu identifikáciu analytu sú aplikovateľné so separačnými jednotkami on-line prepojené hmotnostné spektrometre na báze „triple quadrupole” (3Q MS) alebo na báze „time-of-flight” (Q-TOF MS). Výber zariadení pre laboratórium zároveň vytvára optimálne podmienky pre nové aplikačné stratégie založené na kombináciách jednotlivých separačných a detekčných modulov. Zastúpené sú aj zariadenia na predúpravu vzoriek (krv, plazma, sérum, moč a i.) pred vlastnou analýzou, ako je SPE automat.

Prislúchajúce priestory:

Centrálne analytické laboratórium (CE-3Q MS, HPLC-Q-TOF MS, datastanice, pomocné zariadenia – SPE automat), č. 38
Prístrojovňa (kompresor pre MS, sušiareň, destilačné zariadenie), č. 36
Vstupná hala, č. 37
Sklad (dusíková bomba pre MS, dusíkový generátor pre MS, chladničky, vybrané chemikálie), č. 39
Laboratórium na prípravu vzoriek (digestor, destilačné zariadenie, centrifúga, vybrané chemikálie), č. 6-7

Stručná charakterizácia metód a techník:

Kapilárna elektroforéza (CE) je analytická technika používaná na analytickú separáciu (delenie) zmesi látok. Látky sa navzájom delia v elektrickom poli na základe rozdielov v ich pomere náboj/hmotnosť. CE je technika primárne vhodná pre delenie nabitých alebo ionizovateľných látok ako sú kyseliny, zásady, soli (mnohé liečivá, markery a iné biologicky aktívne látky). Je možné uskutočňovať separáciu, detekciu a stanovenie koncentrácie týchto látok aj v zložitých farmaceutických (liekové formy) a biologických (moč, krv, plazma, sérum, tkanivá, liofilizáty buniek) matriciach. CE je mimoriadne účinná pre ionizovateľné biopolyméry ako sú proteíny a DNA, RNA. Je tak možné získavať profily proteínového zloženia alebo DNA, RNA zloženia v syntetických alebo biologických vzorkách. CE s chirálnym selektorom (t.j. chirálne aditívum sa pridá do CE separačného elektrolytu) sa používa na delenie enantiomérov (D,L-aminokyseliny, D,L-liečivá, atď.). Podobne ako ostatné separačné techniky, CE je najčastejsie prepojená s UV detektorom (deteguje vo vzorke UV absorbujúce látky v koncentračnom rozpätí 10-5-10-7 mol/l), ale v pokročilých aplikáciách sa spája napríklad aj s LIF detektorom (deteguje fluorescenčne aktívne látky prítomné vo vzorke vo veľmi nízkych koncentráciách, 10-8-10-12 mol/l), alebo detektormi s hmotnostnou spektrometriou (MS) (detegujú látky podľa pomeru hmotnosť/náboj, hmotnostné spektrá sú vhodné na štruktúrnu charakterizáciu látky, koncentračná citlivosť je v intervale 10-6-10-9 mol/l).

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (High performance liquid chromatography - HPLC). Chromatografické metódy sú v súčasnosti najrozšírenejším druhom separačných metód. Tvoria štandardnú súčasť vestníka EÚ a ISO noriem v rámci analytických metód. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia sa využíva na separáciu látok v závislosti od výberu stacionárnej fázy. Najbežnejším typom je systém s obrátenými fázami (stacionárna fáza C18), ktorý umožňuje separáciu a následnú detekciu najmä lipofilných látok (liečivá a markery s vysokou molekulovou hmotnosťou). Stacionárne fázy ako HILIC, resp. C4-C5 nám umožňujú pomocou HPLC stanovovať aj látky polárneho charakteru, ako sú nízkomolekulové liečivá, resp. proteíny.

Kvapalinová chromatografia je vysokoúčinná separačná technika, ktorá umožňuje uskutočňovať separáciu a stanovenie koncentrácie horeuvedených analytov aj v zložitých farmaceutických a biologických (moč, krv, plazma, sérum, tkanivá, liofilizáty buniek) matriciach.

Dvojdimenzionálna kvapalinová chromatografia, umožňuje kombináciu nepolárnych (C18) a polárnych (HILIC a C4) stacionárnych fáz, čo zvyšuje separačnú účinnosť oproti jednodimenzionálnej HPLC. Dokonca umožňuje separáciu polárnych aj nepolárnych látok v rámci jednej analýzy i v zložitých biologických matriciach.

Najbežnejším detektorom pre HPLC je DAD (detektor diodového poľa) detektor. Disponovanie dvomi celami s rôznou dĺžkou optickej dráhy (10mm a 60mm) nám umožňuje detegovať opticky aktívne látky v širokom koncentračnom rozsahu. V súčasnej dobe je najviac preferovaným spojením spojenie vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou pre kvalitatívnu aj pre kvantitatívnu analýzu. Toto spojenie je jednou z najlepších možností stanovenia štruktúry látky v on-line spojení so separačnou technikou.

Hmotnostný analyzátor typu trojitý kvadrupól (QQQ) patrí do skupiny tandemových hmotnostných spektrometrov, ktoré umožňujú viacnásobnú selekciu a separáciu hmoty na základe pomeru m/z. Prvý kvadrupól umožňuje výber materského iónu. Druhý kvadrupól plní funkciu kolíznej cely a sprostredkuje fragmentáciu materských iónov na ióny dcérske. Tretí kvadrupól následne sprostredkuje analýzu vyselektovaných dcérskych iónov. QQQ je charakterizovaný vysokou citlivosťou a selektivitou. V spojení s vhodnou separačnou technikou (LC, CE) je vhodným nástrojom pre analýzu (najmä kvantitatívnu) polykomponentných vzoriek, a preto sa stal neodmysliteľnou súčasťou bioanalytiky.

Hmotnostný spektrometer QTOF (Quadrupole-Time Of Flight) predstavuje hybridný hmotnostný spektrometer kombinujúci princípy kvadrupólu (Q) a letovej trubice (TOF). Q v takomto usporiadaní slúži na selekciu materského iónu, jeho fragmentáciu na ióny dcérske, avšak konečné MS spektrum je zaznamenané pomocou TOF. Q-TOF sa vyznačuje vyšším rozlíšením, lepšou presnosťou hmoty a schopnosťou simultánne zaznamenávať všetky fragmenty prichádzajúce k detektoru. V spojení so separačnými technikami (LC, CE) umožňuje nielen analýzu neznámej látky pomocou hmotnostných spektier, ale i rekonštrukciu molekúl neznámych látok a ich porovnanie s databázou látok už dobre známych, čo vedie k detailnej identifikácii chemickej štruktúry separovaných látok. Významné postavenie preto Q-TOF nadobúda na poli proteomiky alebo metabolomiky.

SPE (solid phase extraction)-extrakcia tuhou fázou predstavuje rýchlu a selektívnu metódu na prípravu vzorky. Táto extrakčná metóda je založená na separačnom mechanizme používanom v kvapalinovej chromatografii. Využíva tuhú a kvapalnú fázu na izoláciu jedného analytu, alebo analytov jedného typu z roztoku. Pri tejto metóde sa analyt sorbuje na tuhú fázu z fázy kvapalnej. Interakcie analytu s tuhou fázou musia byť silnejšie než s fázou kvapalnou, v ktorej je analyt rozpustený. Všeobecný postup spočíva v nadávkovaní roztoku s analytom na tuhú fázu SPE kolónky, vo vymytí nežiadúcich komponent a v zachytení analyzovanej látky do zbernej skúmavky po vymytí s iným rozpúšťadlom. SPE využíva rovnaké stacionárne fázy ako kvapalinová chromatografia. SPE metodika sa používa na izoláciu dokazovanej alebo stanovovanej zložky z analyzovanej zmesi, na prečistenie vzorky pred použitím chromatografie alebo inej analytickej metódy a na zakoncentrovanie analytov z vody, alebo iných kvapalných vzoriek. Metóda je rýchla, presná a reprodukovateľná, umožňuje súčasné spracovanie viacerých vzoriek a je ju tiež možné automatizovať.